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研究目的：H3N2流感亚型是季节性流感中最主要的亚型,相较于H1N1 (09pdm)、B型流感具有罹患率高、重症比例高、死亡人数多的特点,是影响人类健康的重要病原体之一。流感病毒第11个蛋白PB1-F2,被认为是流感病毒感染宿主过程中的重要毒力因子,具有影响病毒的复制能力、促进肺组织细胞凋亡以及引起继发性细菌性肺炎等功能。本研究对流感病毒PB1-F2蛋白进化趋势和遗传特征进行分析,结合江苏省流感网络监测系统分析江苏省2012年-2015年101株H3N2流感病毒流行株PB1-F2蛋白遗传进化规律,掌握PB1-F2蛋白的动态进化趋势。为进一步了解H3N2亚型PB1-F2蛋白长度多态性对其功能特征的影响,本研究还展开对H3N2亚型全长型和截短型PB1-F2病毒毒力、致病性和细胞因子变化的初步探讨。此外本研究还为后续深入研究PB1-F2全长型和截短型蛋白功能差异建立流感病毒反向遗传体系,为拯救突变流感毒株、继续探讨其生物学功能奠定坚实的技术基础。研究方法：1.利用NCBI流感数据库下载全球人、禽和株流感病毒PB 1-F2蛋白相关信息和核苷酸序列,PB1-F2断裂数据集利用Excel、SPSS 19.0软件进行统计,核苷酸序列、氨基酸序列使用MEGA6.0.6、DNA Sequence Polymorphism5.1、Fasttree等生物信息学软件进行PB1-F2基因分子进化分析和系统进化树构建。2.江苏省流感网络监测实验室分离培养甲型H3N2流感毒株101株,利用ContingExpress Aplication软件对测序结果进行序列拼接,得到PB1核苷酸序列,采用MEGA 6.0.6软件进行核苷酸序列比对(ClustalW法),对PB1及PB1-F2氨基酸位点的改变进行分析,利用Fasttree软件绘制PB1基因编码区核苷酸序列的进化树。使用在线工具Datamonkey (http:/www.datamonkey.org)对PB1节段进行选择压力分析。3.选择PB1-F2蛋白断裂株F1345和全长株S1238感染MDCK和A549细胞,利用酶联免疫法检测流感病毒感染MDCK细胞过程中复制能力差异,MTT法用以检测PB1-F2蛋白断裂与否对细胞凋亡的影响,RT-PCR法检测A549细胞受感染后细胞因子mRNA相对表达水平。4.定点突变PB1-F2蛋白断裂株F1345毒株PB1-F2终止密码子TAA为CAA,利用8质粒系统拯救F1345突变株(全长型PBl-F2)建立反向遗传体系。研究结果：1.PB1-F2蛋白断裂株分布：GeneBank流感数据库中下载宿主为人类、禽类和猪的流感病毒,PB1-F2蛋白分离率为24.35%,其中人H1N1亚型PB1-F2蛋白自1948年后几乎全部为断裂型PB1-F2毒株。人H3N2亚型于1996年发现PB1-F2蛋白断裂株,占10.07%,且分离率呈上升趋势。禽流感病毒断裂株比例最低为6.47%。2.PB1-F2蛋白遗传特征和系统发育树：H3N2和H1N1亚型流感病毒PB1-F2基因核苷酸同源性分别为97.02%-100%、79.20%-100%。H1N1亚型PB1-F2基因转换与颠换比率最低为3.86。人流感H3N2和H1N2平均多态性位点比和平均进化距离分别0.0705和0.0347,季节性人H1N1流感亚型平均多态性位点和平均进化距离为0.0733和0.0609,相比人流感H3N2和H1N2亚型病毒其平均遗传距离较小。各亚型PB1-F2基因非同一突变和同义突变(dN/dS)均大于1。PB1-F2位于PB1基因,构建系统进化树可大致分为7个进化分支,分支Ⅰ为人H3N2和H1N2亚型,分支Ⅱ为猪H1N1、H3N2、H1N2亚型,分支Ⅲ为人H2N2亚型,分支Ⅳ和Ⅴ为禽流感毒株,其中分支Ⅳ主要来源于美洲和大洋洲,分支V主要为亚欧地区毒株；分支Ⅵ为猪流感,主要为分离自欧洲国家和地区的甲型H1N1和H3N2流感亚型；分支Ⅶ为人H1N1流感病毒。3.江苏省H3N2流感毒株PB1-F2基因监测：193株H3N2流感病毒总体上分为4个分支,江苏省H3N2亚型分离毒株以及2002-2015年分离毒株位于第Ⅳ分支上,1968-1994年分离毒株位于第Ⅱ和Ⅲ分支；分子特征显示PB1氨基酸52、113、179、216、576、586、619、621、709位在2002年以后发生适应性改变,替换了原来的氨基酸；PB1-F2基因编码截断型蛋白长度有52aa、34aa、25aa、24aa、11aa(猪源),PB1-F2蛋白毒力关键位点上未出现高致病性特征突变。4.PB1-F2蛋白断裂进化特征的功能改变：F1345(PB1-F2截短型)和S1238(PB1-F2全长型)在感染MDCK细胞后,两类病毒导致细胞死亡的数量随时间呈现递减趋势,其中S1238感染细胞后,细胞存活率低于F1345毒株(P=0.0906)。S1238在感染12h-36h之间病毒的复制能力要高于F1345毒株,36h之后F1345毒株复制能力明显上升,各时间点S1238和F1345毒株的吸光度值差异均有统计学意义。RT-PCR检测F1345和S1238两毒株感染后A549细胞炎症因子和趋化因子(IL、IL-8、IFNα、IFNβ、IFNγ、MCP-1)的]mRNA相对表达水平,IL-8在感染8h后相对表达水平最高,IFNα/β在感染32h后表达水平显著上升,除MCP-1外PB1-F2断裂株和全长株细胞因子表达水平均无统计学意义。5.流感病毒反向遗传体系建立：基因突变F1345 (PB1-F2截短型)PB1-F2开放阅读框内T76C,终止密码子TAA突变为谷氨酰胺CAA。构建PHW2000-PB1(WT)、 PHW2000-PB2、PHW2000-PA、PHW2000-HA、PHW2000-NA、PHW2000-M、 PHW2000-NP、PHW2000-NS8个内部基因双向逆转录表达质粒和1个突变株PB1基因质粒PHW2000-PB1 (MU),共转染293T细胞与MDCK混合培养细胞拯救野生断裂型PB1-F2毒株A/Nanjing/1655/2010 (H3N2)和突变全长型PB1-F2毒株F1345 (MU),建立流感病毒反向遗传系统,为后续探讨流感病毒PB1-F2蛋白变异与功能的机制研究奠定了坚实的基础。结论：1.季节性人流感病毒H3N2亚型PB1-F2蛋白断裂株比例逐年上升,进化速率呈现缓慢而稳定的变化规律,H3N2亚型PB1-F2截短型病毒逐渐成为一种进化趋势。2.2012-2015年江苏省PB1-F2基因高度集中于同一进化分支上,同全国H3N2亚型PB1-F2进化趋势保持一致,且未发现江苏省分离毒株PB1-F2蛋白氨基酸出现高致病性特征突变。3.F1345和S1238毒株PB1-F2蛋白的长度多态性引起病毒在细胞中增殖能力改变,全长型复制能力高于断裂型毒株,而在引起细胞凋亡方面尚未发现显著差异性。4.PB1-F2蛋白截短株和全长株引起A549细胞因子变化主要反应在MCP-1趋化因子上。但还尚不能明确地认为PB1-F2蛋白断裂对流感病毒细胞因子变化的影响,主要原因是实验中采用的流感毒株虽经过基因测序显示两毒株序列同源性较高,但仍存在抗原位点的差异,从而影响实验结果的准确性。只有通过人为的、有针对性的进行基因突变和保真性高的克隆操作,建立起流感病毒的反向遗传体系,确保对照组和实验组在其他基因上的序列完全一致,进而控制了其他片段的影响,才能准确的分析PB1-F2对病毒功能的影响。