第一部分大鼠股动脉灌注局部免疫抑制模型的建立背景高血药浓度伴随的毒副作用是困扰移植研究的难题,而移植物组织内的药物浓度又是延长其存活的关键因素。肿瘤学的经验证明,局部用药是降低全身血药浓度、提高靶向组织药物利用率的一条可行出路。多种免疫抑制剂已被证明可通过动脉直接灌注的方式成倍提高移植物内的药物浓度。但既往研究所用药物老旧,且由于缺乏有效的药物缓释工具,无法对免疫抑制剂的长期动脉灌注进行跟踪观察。随着环孢素等强效免疫抑制剂的广泛应用,以及各种新型药物缓释工具的推广,使得动脉内长期药物灌注成为可能。目的通过构建大鼠肢体再植模型,模拟异体移植的血运状态,分析环孢素A动脉灌注的药物动力学特点,探讨局部动脉灌注长期免疫抑制的可行性。方法1.实验动物分组SPF级成年雄性SD大鼠60只,体重300～350g。大鼠随机等分为“口服灌胃组”、“腹腔注射组”、“静脉灌注组”和“动脉灌注组”。每组分别下设3个亚组,每亚组5只,分别对应2.5mg·kg-1·day-1、5.0mg·kg-1·day-1、10mg·kg-1·day-1三种不同等级的环孢素给药剂量。2.肢体再植模型所有受试大鼠于右后肢横行截肢后原位再植,于右股骨中段离断所有血管神经束和大腿肌群,锯断股骨。随后以18G不锈钢针头对股骨行原位髓内固定。以标准显微外科技术吻合股动静脉和坐骨神经。丝线间断缝合肌肉和皮肤3.环孢素A干预所有实验动物给予环孢素A持续免疫抑制60天。口服灌胃组和腹腔注射组每日予环孢素间断给药一次。静脉灌注组和动脉灌注组大鼠背部皮下埋置灌注专用Smith受药接头,并行再植肢体(右侧)股动静脉插管,以微量泵每日持续灌注等量药物。各亚组分别给予环孢素2.5、5.0、10mg·kg-1·day-1。血管内药物投放采用“环孢素保存液+低分子右旋糖酐抗凝稀释液”的分段式双通道预混合灌注模式,避免药物旷置分解及血栓等并发症。4.环孢素血药浓度检测观察到期后采集大鼠胸主动脉全血样本,以酶放大免疫法测定外周血环孢素药物浓度,比较不同给药途径所得的全身血药浓度,及不同给药方式的血药浓度的转化率。5.再植肢体环孢素组织浓度检测60天末取再植肢体皮肤与肌肉标本,经组织碎化处理后制备匀浆液,以酶放大免疫法测定组织内环孢素药物浓度。分析动脉灌注环孢素的局部药物浓度优势。6.统计学分析实验数据以“均数士标准差”表示,经SPSS13.0软件采用单向方差分析(ANOVA)和析因方差分析进行统计处理,比较不同给药途径对环孢素全身血药浓度的影响,分析不同给药途径对于提高组织内药物浓度的效率。结果1.大体观察腹腔注射组有40%(5例中的2例)大鼠因长期反复注射出现腹腔感染,静脉灌注组中有2例怀疑死于高浓度环孢素蓄积导致的药物毒性。口服灌胃组和动脉灌注组大鼠耐受良好。动脉灌注组未发生感染、血栓等并发症。2.血药浓度比较动脉直接灌注环孢素使得血药浓度较静脉用药降低28%～40%(P<0.05)。给予低剂量(2.5mg·kg-1·day-1)环孢素时,动脉灌注组血药浓度略高于口服组和腹腔注射组。灌注“中等-高”剂量(5～10mg·kg-1·day-1)环孢素时,所得全身血药浓度与口服和腹腔注射相当。口服环孢素A的生物学转化率约为23%～52%,随剂量增大吸收率逐渐提高,显示胃肠道对环孢素的首关消除作用有饱和现象。腹腔注射环孢素转化率为43%～69%,中等剂量下(5mg·kg-1·day-1)利用率最高。动脉灌注环孢素利用率较为恒定,为60%～72%。3.再植肢体组织内环孢素浓度比较动脉灌注组皮肤组织环孢素浓度为等剂量口服组的4.6～25.9倍,腹腔组的4.1～14.5倍,静脉组2.4～5.1倍。肌肉内药物浓度分别为等剂量口服组3.2～12倍,腹腔组3.3～7.9倍,静脉组的1.7～3.3倍。结论局部动脉灌注环孢素与全身用药相比,能有效降低全身血药浓度,成倍提高目标组织内的药物在浓度。单一肢体的长期动脉灌注模型稳定可靠。第二部分环孢素A局部动脉灌注在大鼠肢体移植中的应用背景已有多种药物被证明可通过局部动脉灌注促进移植物的存活。但既往研究所用药物因效能不佳均已淘汰。环孢素临床应用成熟,且已被已被证明可通过局部外用发挥免疫抑制作用。药物动力学研究显示环孢素动脉直接灌注可进一步提高其在移植物中的分布,但其实际抗排斥效果,尤其是长期灌注的效能尚未得到验证。目的通过构建大鼠后肢异体移植模型,研究动脉直接灌注环孢素A对移植物存活的影响,探讨动脉灌注局部免疫抑制的可行性,分析长期动脉灌注下环孢素在内脏的蓄积作用,为局部免疫抑制的临床应用积累理论基础。方法1.大鼠异体后肢移植模型构建通过标准显微血管外科技术构建异种大鼠后肢再植模型。选取近交系棕色Brown Norway大鼠(BN:RT1n)和白色Lewis大鼠(LEW; RTl1)分别作为后肢的供体和受体。受体大鼠术前一天给予兔抗大鼠淋巴细胞血清1.0ml+环孢素10mg·kg-1·day-1腹腔注射一次进行免疫诱导。于供体BN大鼠右股骨中段横行截肢,离断所有股血管神经束及股骨。受体LEW大鼠同等平面截肢,以显微血管外科技术“端一端”吻合供受体股动静脉和坐骨神经。股骨断端以18G髓内钉固定。肌肉、皮肤行间断缝合。另取Lew大鼠以同法截肢后原位再植作为同系移植对照。2.实验动物分组受体Lewis大鼠5只接受自体后肢再植作为同系移植对照组(Iso)。单纯异体移植组(Allo)5只,仅行异体后肢移植而不接受免疫抑制疗程,作为对照。另选异体移植大鼠(54只)接受环孢素A持续免疫抑制,并按给药途径随机分成腹腔注射组(I.P.)、静脉灌注组(I.V.)和动脉灌注组(I.A.)。各组下设3个亚组,分别给予2.5、5.0、10mg·kg-1·day-1三种剂量的环孢素。腹腔注射组每日予腹腔药物注射一次,动脉灌注组和静脉灌注组行股动静脉置管,每日予等量药物以微量泵行连续血管内灌注。3.长期灌注模型的实现动脉和静脉灌注组大鼠接受肢体移植后,采用“体内段+体外段”的分段式灌注管路,构建长期血管灌注通道。体内段包含大鼠背部皮下埋置专用受药接头泵,连接聚氨酯抗凝导管植入大鼠移植肢体股动静脉。体外段管路以微量泵经特殊皮外接头注入皮下受药接头,与体内段实现连接。体内段长期封闭于皮下,避免长期留置引起的感染。体外段便于拆卸、更换及定期消毒。免疫抑制剂药液采用“环孢素保存液+肝素化低分子右旋糖抗凝稀释液”双通道预混合方式输注。药物以原液形式保存,与稀释液在三通管内即时混合后注入血管,避免药液长期旷置引起的分解及毒性增高。抗凝稀释液采用临床封管液材料,最大限度降低导管血栓机率。4.生存期观察每日记录移植物存活情况,出现不可逆性严重排斥反应(临床评分3级以上)或肢体存活超过100天作为观察终点。对比不同给药途径和不同环孢素剂量下移植物的存活期差异。5.移植物组织学比较观察中止后对移植物行常规脱水、石蜡包埋、切片。行苏木精一依红染色,并行组织病理学观察,比较不同给药途径下的排斥反应特点。6.移植物排斥度病理评分对肢体长期存活的个体,取移植物前、后、内、外四处皮肤组织,按Banff2007复合组织移植物病理评分,计算移植物平均排斥度。比较不同给药途径对移植物排斥程度的影响。7.内脏药物蓄积比较对移植物长期存活的大鼠,切取其肝脏和右侧肾脏,经碎化处理后制备组织匀浆,以酶放大免疫法检测组织内环孢素药物浓度,评价长期灌注后内脏药物蓄积情况。8.统计学分析实验数据以SPSS13.0软件采用单向方差分析(ANOVA)和析因方差分析进行统计处理,排斥度等级资料采用非参数秩和检验。结果1.大体观察自体再植对照组大鼠无任何排斥迹象。单纯移植组大鼠无一例外出现严重排斥反应,移植物出现进行性红斑、皮疹、脱毛、肢体肿胀,直至最终肢体坏死脱落。各环孢素干预组中未达长期存活个体,最终肢体反应与单纯移植组类似。环孢素剂量为2.5mg·kg-1·day-1时,动脉灌注组以肢体肿胀为主的体液免疫表现较为明显,而局部皮肤损害较全身用药组略轻。大剂量环孢素治疗时,腹腔注射组2例出现反复注射引起的腹腔感染。静脉组部分大鼠出现活动减少、精神差等药物毒性反应。其中两例大鼠怀疑因不耐受大剂量药物的长期蓄积而死亡。腹腔注射组和静脉灌注组毛发再生缓慢或再生不全,肢体反复出现红斑、肿胀等慢性排斥反应直至最后瘢痕形成。动脉灌注组大鼠无明显不良反应,仅有2例大鼠出现术后移植物伤口愈合稍迟。考虑与皮肤组织环孢素浓度高,抑制组织活力有关。2.生存期观察所有经环孢素干预大鼠的移植物存活期均较单纯异体移植组延长,显示环孢素应用有利于移植物存活。单纯动脉灌注小剂量环孢素(2.5mg·kg-1·day-1)无法实现移植物长期存活,但平均存活天数为39.4±9.1天,显著高于等剂量静脉灌注组(21.0±3.9,P<0.05)和腹腔注射组(13.6土1.9天,P<0.01)。给予中等剂量环孢素(5.0mg·kg-1·day-1)时,仅动脉灌注组大鼠肢体长期存活(>100天),显著优于腹腔注射组的46.4±7.0天和静脉灌注组的56.4±7.0天。大剂量(10mg·kg-1·day-1)时,三种给药途径大鼠移植物均能实现移植物长期存活,肢体存活期无统计学差异。3.组织学观察单纯移植组表现为典型的排斥反应,皮肤溶解坏死,移植物大量单核细胞浸润。小剂量环孢素治疗下,三种给药途径的病理学表现与单纯移植组类似,动脉灌注组集中表现为血管周围炎症,皮肤与结缔组织淋巴细胞浸润较轻。中等-大剂量环孢素治疗时,腹腔注射组和静脉灌注组大鼠移植物中仍可见不同程度排斥反应。动脉组仅有极少单核细胞浸润或轻微血管周围炎症,部分大鼠移植物完全无排斥反应表现。4.评价排斥度比较长期存活移植物组织学评分显示,动脉灌注组平均排斥度显著小于等剂量腹腔注射组和静脉灌注组(P<O.01)。5.长期灌注内脏药物蓄积比较经动脉灌注后,肝脏药物环孢素浓度较腹腔注射和静脉用药分别下降了19%和35%(P<0.01)。肾脏组织CSA浓度较静脉组下降31%,与腹腔组相比无显著性差异。结论各种给药途径应用环孢素均可促进移植物存活。尤以动脉直接灌注更能延长移植物存活时间,降低排斥反应程度,长期应用可以减少肝肾药物蓄积。环孢素单一药物全身性给药,即便采用大剂量仍无法戒绝复合组织移植的排斥反应。动脉灌注中等剂量环孢素即可实现免疫耐受,完全抑制排斥现象。单纯小剂量环孢素即便采用局部动脉灌注仍不能避免排斥反应。维持一定水平的全身血药浓度有助于控制体液免疫水平,对于促进移植物的长期存活仍十分必要。