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甘蔗鞭黑粉病菌是一种既有单倍体的单胞菌体又有双核菌丝的两型真菌。前者可长期营腐生生活,但不能侵入甘蔗。后者只生长在甘蔗活组织内,其形成必须经由两个具有亲和性的单倍体菌体配合。本研究根据甘蔗鞭黑粉菌生活史的这一特点,以干扰或阻止其有性配合为目标,对分自甘蔗植株、甘蔗生境以及自然环境中各类型基质的细菌菌株进行了筛选,并以其中一株革兰氏阳性细菌为材料,进行了发酵条件的优化实验,并分离、提纯和鉴定该细菌产生的活性成分,为甘蔗鞭黑穗病的生物防治提供了理论依据。主要研究结果如下:
从甘蔗植株表面及内部、甘蔗生境以及周围环境其它各类型基质中采用平板稀释法分离出具有不同培养性状的细菌单菌落2938个。通过初步筛选得到可有效抑制甘蔗鞭黑粉菌有性配合而不影响其单性系正常生长或影响很小的生防细菌菌株287个。经再次筛选和实验,只发现3个菌株产生的生物活性物质可以耐100~C热处理。通过革兰氏染色法可知其中1株为革兰氏阳性细菌,2株为革兰氏阴性细菌。
对其中一株能产生热稳定活性物质的革兰氏阳性细菌B78进行了深入研究。经过形态学、BIOLOG系统测定与16SrDNA序列分析,将该菌株鉴定为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)。采用单因素实验设计,探讨了各培养条件对菌株B78生长量及活性物质产量的影响,其影响因素分别为培养基种类、培养时间、培养温度、培养基初始pH值、振荡培养速度以及培养基装液量。在单因素实验结果基础上,进一步通过中心组合实验设计,建立了供试菌株B78的最佳培养条件:即培养基初始pH值为8、培养时间72h、振荡速度200rpm、培养温度28℃,为较大规模地发酵培养提取活性物质奠定了基础。
综合应用硅胶柱层析、凝胶柱层析以及硅胶薄层层析(TLC)等方法,从供试菌株B78发酵液乙酸乙酯(EtOAc)萃取物中分离提纯了活性成分。经硅胶柱(Silicagel)层析后得到E1一E5共5个组分。根据生物活性的测定结果,选择组分E2继续用凝胶柱(SephadexLH-20)反复分离纯化最终得到单体成分1个,记为Spl。对组分E1一E5及单体化合物Spl进行了生物活性测定实验,结果表明,组分E2对靶标真菌有性配合的抑制效果高于组分E1、E3、E4及E5,最低抑菌浓度为0.25mg/mL。单体化合物Spl的活性略低于组分E2,最低抑菌浓度为0.5mg/mL,推测本试验的供试菌株B78的活性物质可能是由具有某种共同的分子结构而骨架长短有差异的系列物质组成。
经过核磁共振谱(包括1H-NMR、13C-NMR、1H-1HCOSY、1H-13CHMBC、IH-13CHMQC、DEPT等)、质谱(EI-MS)等现代波谱技术对单体化合物Spl进行了鉴定,该化合物为脯氨酰亮氨酸环二肽。