目的乳腺癌是严重威胁女性生命健康的恶性肿瘤之一,发病率呈逐年递增的趋势,已居女性癌症发病率的首位。三阴性乳腺癌(TNBC)是一种特殊类型的乳腺癌,约占所有乳腺癌类型的15%。TNBC具有局部复发率高、易转移、缺乏特异性治疗靶点、化疗易耐药等特点,目前尚无针对性的治疗方案。光动力疗法联合化疗对TNBC表现显著的协同治疗作用,因此探索有效的联合策略和方法具有重要的临床意义。本研究以含有二硫键的聚β-氨基酯(ss PBAE)/聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)的复合纳米载体共载第二代光敏剂二氢卟吩e6(Ce6)和一线化疗药物阿霉素(DOX),制备ss PBAE/PLGA/Ce6/DOX载药纳米核(PPCD);提取高表达肿瘤归巢肽RGD的细胞膜(RGD-MEM),并将其包裹于PPCD纳米核表面,构建同时具有主动靶向和同源靶向能力的RGD-MEM@ss PBAE/PLGA/Ce6/DOX仿生纳米治疗体系(RMPPCD纳米粒),以期实现联合光动力与化疗靶向治疗三阴性乳腺癌的目的。内容本研究共分为以下两个部分:第一部分为RMPPCD纳米粒的制备与表征。主要包括p CDH-p-RGD-Ecadherin重组质粒(p CDH-p-RGD-Ecad)的构建及其对MDA-MB-231细胞的转染;在基因与蛋白水平验证转染后细胞表达RGD-Ecad的水平。制备PPCD纳米核,然后提取RGD-MEM包覆于其表面,构建RMPPCD纳米粒;对RMPPCD纳米粒进行各种表征,并检测其体外释药性能。第二部分为RMPPCD纳米粒在细胞水平的作用评价。主要包括RMPPCD纳米粒对MDA-MB-231细胞的靶向性验证、光动力效率考察、细胞凋亡诱导作用及其机制研究、细胞周期阻滞性能以及细胞杀伤效应评价;制备MDA-MB-231细胞的3D肿瘤球,体外考察RMPPCD纳米粒的肿瘤渗透性能。方法1.RMPPCD纳米粒的制备与表征:构建p CDH-p-RGD-Ecad质粒,采用慢病毒载体转染MDA-MB-231细胞,构建细胞膜上高表达RGD的MDA-MB-231稳转细胞系(RGD-231)。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)、凝胶电泳实验和蛋白质印迹法(Western blotting)考察RGD-Ecad在RGD-231细胞中m RNA与蛋白表达水平;提取RGD-MEM,通过银染实验进行全蛋白成分分析。参考本课题组前期研究,通过两步化学反应制备得到ss PBAE,并以核磁共振氢谱(~1H NMR)确证其化学结构。以ss PBAE与PLGA为材料,采用超声乳化-溶剂挥发法制备共载Ce6和DOX的PPCD纳米核;提取RGD-MEM,采用共挤出的方法将RGD-MEM包裹于PPCD纳米核表面,制备得到RMPPCD纳米粒。同时,提取MDA-MB-231细胞膜包裹在PPCD表面得到MPPCD纳米粒,以其作为对照。利用透射电子显微镜(TEM)观察PPCD纳米核和RMPPCD纳米粒的形态结构,通过动态激光散射法和Zeta电位分析仪考察PPCD纳米核和RMPPCD纳米粒的粒径和粒径分布、表面荷电性质及体外稳定性。通过Western blotting实验确证RGD-Ecad在RMPPCD纳米粒表面的存在,利用紫外-可见分光光度计和荧光分光光度计考察纳米粒的光学性质,利用高效液相色谱(HPLC)考察纳米粒中Ce6和DOX的载药量和包封率,采用动态透析法考察纳米粒的释药能力。2.RMPPCD纳米粒在细胞水平的作用评价:采用激光共聚焦显微镜观察RMPPCD纳米粒在MDA-MB-231细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的蓄积和亚细胞分布;采用流式细胞术定量检测MDA-MB-231细胞和HUVECs对RMPPCD纳米粒的摄取情况;采用DCFH-DA荧光探针在细胞水平检测活性氧(ROS)的释放,进而考察纳米粒的光动力效率;采用Western blotting实验检测细胞内caspase 9、caspase 3和Bcl-2的表达水平,探究纳米粒的细胞凋亡诱导作用及其作用机制;采用PI染色法考察纳米粒对细胞周期分布的影响;采用活/死细胞染色法和MTT实验考察纳米粒对MDA-MB-231细胞的杀伤效应;体外培养MDA-MB-231细胞的3D肿瘤球,考察纳米粒在肿瘤球中的渗透能力。以上实验设置游离Ce6、PPCD纳米核与MPPCD纳米粒对照组,通过实验结果的比较综合评价RMPPCD对MDA-MB-231细胞的同源靶向和主动靶向能力,及其对MDA-MB-231细胞的光动力和化疗的联合治疗作用。结果1.构建了细胞膜上稳定高表达RGD的RGD-231稳转细胞系,并通过q RT-PCR实验、DNA凝胶电泳实验、Western blotting实验和银染实验在m RNA水平和蛋白水平验证了RGD在RGD-231细胞膜的高表达。~1H NMR的特征峰分析结果显示ss PBAE成功合成。制备得到RMPPCD纳米粒,TEM图像显示RMPPCD纳米粒有明显细胞膜包覆结构,动态激光散射法和Zeta电位分析仪结果显示RMPPCD纳米粒的粒径和Zeta电位为167.8 nm和?24.9,具有良好的体外稳定性和血清稳定性,Western blotting结果显示RGD-Ecad在纳米粒外层细胞膜中的存在,说明本研究采用的制备方法对细胞膜生物活性无影响,紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱共同证明光敏剂Ce6和化疗药物DOX的共载和其光学特性的保留。使用HPLC检测并计算得到RMPPCD纳米粒中Ce6的载药量和包封率分别为3.9%和78%,DOX的载药量和包封率分别为0.403%和80.6%,体外药物释放实验说明纳米粒中DOX的释放具有p H和氧化还原双重响应性。2.将经RMPPCD纳米粒与游离Ce6、PPCD纳米核和MPPCD纳米粒处理的细胞比较后的实验结果如下。激光共聚焦显微镜观察显示RMPPCD纳米粒主要分布于MDA-MB-231细胞和HUVECs的胞质中;流式细胞术检测结果说明MDA-MB-231细胞和HUVECs对RMPPCD纳米粒的摄取能力最强。在近红外光照射的条件下,RMPPCD纳米粒诱导细胞产生ROS的水平最高,说明RMPPCD纳米粒可以携载Ce6入胞并有效发挥良好的光动力治疗效果。Western blotting实验结果显示,RMPPCD纳米粒是通过激活线粒体通路来诱导细胞凋亡的。细胞周期实验结果说明RMPPCD阻滞细胞周期于G2/M期。活/死细胞染色法和MTT的实验结果说明,在近红外光照射的条件下,RMPPCD纳米粒表现出明显强于其它对照组的细胞杀伤能力。3D细胞培养实验显示RMPPCD纳米粒在MDA-MB-231细胞构建的肿瘤球中渗透能力最强。以上实验结果表明RMPPCD纳米粒兼具同源靶向和主动靶向的双重靶向能力,并且能够在MDA-MB-231细胞中有效释放药物从而实现光动力与化疗联合治疗的作用。结论本研究成功制备了同时携载光敏剂Ce6和化疗药物DOX的仿生纳米治疗体系RMPPCD纳米粒。各种表征结果显示RMPPCD纳米粒具有典型的“核-壳”结构、良好的体外稳定性以及p H和氧化还原双重响应释药能力。细胞实验结果显示,RMPPCD纳米粒能够有效靶向MDA-MB-231细胞并响应胞内p H与还原环境释放药物,进而发挥光动力和化疗的联合治疗作用。综上,本研究为靶向TNBC递送药物提供了新的载体形式,为临床TNBC治疗提供了新的策略。