论文部分内容阅读
目的 进行PPARγ、PPARα、PPRE表达载体的构建、扩增与提取,组建具有较高灵敏性的PPRE荧光素酶筛选系统。方法 用RT-PCR方法扩增小鼠PPARγ和PPARα DNA片段,重组到pCMX表达质粒,将合成的PPRE DNA亚克隆到pGL3荧光素酶表达质粒,提取质粒DNA。应用脂质体（SuperFect）将pGL3-CMV、PPARγ和PPRE与pRL转染COS-7细胞和HepG2细胞,24h后分别加入pGL3-CMV及不同剂量的吡格列酮（PGZ）,继续孵育24h,应用双报告荧光素酶基因检测系统检测荧光素酶活性。结果 （1）提取后的PPARγ、PPARα及PPRE表达载体,经测序证实无突变插入方向正确,表达载体以环状DNA为主。（2）pGL3-CMV明显增强荧光素酶活性为对照组的14.9倍（P<0.01）,PGZ呈剂量依存性地增强PPARγ活性,PGZ 10-5达到最高值为对照组的6.1倍（P<0.01）;（3）PGZ10-6、10-5增强HepG2细胞荧光素酶活性分别为对照组的3.6（P<0.01）、5.4倍（P<0.01）。结论 成功地进行了PPARγ、PPARα、PPRE质粒的构建、扩增与提取,组建了具有较高敏感性的PPARs表达筛选系统。