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胶质母细胞瘤是侵润性强、恶性度高的致死性成人中枢神经系统肿瘤。对放疗和化疗均耐受。因侵润性较强,手术不能达到全切。尽管胶质母细胞瘤的诊疗和基础研究已经取得显著进展,但临床患者预后仍极不理想,胶质母细胞瘤的靶向治疗急待进一步发掘。核因子E2相关因子2(Nrf2)是细胞调节抗氧化应激反应的重要转录因子。主要通过与抗氧化顺式作用元件结合以调控ARE控制基因的表达。ARE控制基因包括抗氧化酶基因、Ⅱ相解毒酶基因、多种转运蛋白。除了介导抗氧化酶基因和解毒基因的表达,Nrf2还可广泛地调控细胞的多种代谢,如抑制脂肪合成,促进脂肪酸β氧化,促进磷酸戊糖代谢,增加GSH生成、NADPH再生和嘌呤生物合成。Nrf2和Nrf2调控的下游基因对减轻或消除毒物、致癌物的毒性作用至关重要,给予天然或人工合成化合物激活Nrf2通路,可发挥解除毒物、致癌物毒性的作用。然而,最近不断增加的研究表明核因子Nrf2在肿瘤发生、发展的病理生理过程中具有"黑暗"的一面:Nrf2和其调控的下游基因在许多肿瘤细胞或组织中高表达,并且促进肿瘤细胞生存和增殖。此外,Nrf2可增强肿瘤对化疗药物的耐受性,是肿瘤耐药的重要原因。我们将研究核因子Nrf2在胶质母细胞瘤增殖和耐药中所发挥的作用,并从细胞代谢角度阐明Nrf2发挥促癌作用的机制。本课题共分成以下四个研究部分:第一部分核因子Nrf2在胶质母细胞瘤细胞系中的表达模式及其对细胞增殖的影响目的:研究核因子Nrf2在胶质母细胞瘤细胞系中的表达模式及评估其对细胞增殖的影响。方法:蛋白免疫印迹电泳和实时定量聚合酶链式反应评估核因子Nrf2在胶质母细胞瘤细胞系中的表达模式;慢病毒介导的短发夹RNA感染细胞下调细胞内Nrf2。细胞的增殖由CCK-8法评估。结果:和正常人脑星形细胞比较,四种胶质母细胞瘤细胞系(U251、U87、A172和SHG44)中Nrf2均高表达,其中U251细胞系的Nrf2表达水平最高,增殖速度也最快。通过慢病毒介导的shRNA感染细胞可成功建立Nrf2稳定下调的细胞系U251。核因子Nrf2下调后,胶质母细胞瘤细胞生长曲线变平缓,平板克隆实验形成的克隆直径变小,克隆形成减少。结论:和正常人脑星形细胞(NHA)比较,胶质母细胞瘤细胞系中的Nrf2均高表达,其中U251细胞系Nrf2的表达水平最高。细胞内核因子Nrf2的表达水平和细胞增殖速度呈正相关。慢病毒介导的shRNA感染细胞可成功建立Nrf2稳定下调的细胞系。核因子Nrf2下调后胶质母细胞瘤细胞增殖明显受到抑制。第二部分核因子Nrf2调控的能量代谢在胶质母细胞瘤细胞系增殖中的作用目的:研究Nrf2调控的能量代谢和能量代谢敏感AMPK-mTOR信号通路在胶质母细胞瘤增殖中的作用。方法:慢病毒介导的短发夹RNA感染细胞下调细胞内Nrf2。细胞内ATP水平通过萤火虫荧光素酶为基础的荧光分光光度法检测。细胞内AMP/ATP比值由高效液相色谱法检测。细胞的增殖由CCK-8法评估。细胞内AMPK-mTOR通路状态由蛋白免疫印迹电泳评估。结果:核因子Nrf2下调后,细胞内ATP水平明显下降,AMP/ATP比值相应显著升高。并且核因子Nrf2下调后,细胞内能量代谢敏感AMPK通路也激活。给予AMPK特异性激动剂苯乙基双胍可模拟核因子Nrf2下调诱导的细胞增殖抑制和能量代谢障碍。结论:核因子Nrf2下调诱导的增殖抑制由能量代谢障碍和能量代谢敏感的AMPK通路激活所介导。第三部分核因子Nrf2依赖的GSH生成在胶质母细胞瘤增殖中的作用目的:研究核因子Nrf2依赖的GSH生成在胶质母细胞瘤增殖中的作用及机制。方法:慢病毒介导的短发夹RNA感染细胞下调细胞内Nrf2。细胞内ROS水平由荧光分光光度法检测。细胞内GSH水平由分光光度法检测。细胞的增殖由CCK-8法评估。细胞内AKT、ERK1/2和STAT3活化状态由蛋白免疫印迹电泳评估。结果:核因子Nrf2下调后,细胞内GSH水平明显下降,ROS水平相应显著升高。并且核因子Nrf2下调后,胶质母细胞瘤细胞生长曲线变平缓,平板克隆实验形成的克隆直径变小,克隆形成减少。核因子Nrf2下调后,细胞内AKT、ERK1/2活化水平受抑制(STAT3活化状态变化不明显)。外源性给予NAC可清除细胞内升高的ROS,但不能恢复细胞内下降的GSH,也不能逆转Nrf2下调诱导的增殖抑制,而外源性给予GSH可清除细胞内升高的ROS,能恢复细胞内下降的GSH,还可显著逆转Nrf2下调诱导的增殖抑制。最后,给予AKT抑制剂(AKT inhibitor Ⅳ)、ERK1/2 抑制剂(U0126)和 STAT3 抑制剂(AG490),只有AKT抑制剂AKT inhibitor Ⅳ可对抗GSH的逆转作用。结论:细胞内GSH水平下降和AKT通路抑制在核因子Nrf2下调诱导的胶质母细胞瘤增殖抑制中发挥重要作用。第四部分核因子Nrf2依赖的GSH生成在胶质母细胞瘤TMZ耐药中的作用目的:研究核因子Nrf2依赖的GSH生成在胶质母细胞瘤TMZ耐药中的作用。方法:采用TMZ间歇浓度梯度递增法诱导建立胶质母细胞瘤耐药细胞株U251TR和U87TR。CCK-8法评估耐药细胞的IC50和耐药指数。分光光度法检测细胞内GSH水平。蛋白免疫印迹电泳检测细胞内核因子Nrf2及GSH净生成相关的多种酶(GCLC、GS和GR)的表达水平。慢病毒介导的短发夹RNA感染细胞下调细胞内Nrf2。CCK-8法评估替莫唑胺对耐药细胞U251TR和U87TR的毒性和增殖抑制作用。结果:通过体外分步诱导法成功建立了对替莫唑胺具有稳定耐药性的U251TR和U87TR细胞株。CCK-8法检测显示U251TR的耐药指数为10.92,U87TR的耐药指数为10.35。耐药细胞内GSH明显升高:U251TR较U251升高约3.7倍,U87TR较U87升高约2.4倍。蛋白免疫印迹电泳表明:在耐药细胞内核因子Nrf2及GSH净生成相关酶(GCLC、GS和GR)表达上调,而慢病毒介导的短发夹RNA下调TMZ耐药细胞内Nrf2后,TMZ耐药细胞系细胞内GSH水平明显下降,U251TR和U87TR细胞内GSH净生成相关酶(GCLC、GS和GR)表达亦降低。最后,CCK-8法检测表明:细胞内Nrf2下调后,可逆转耐药细胞对替莫唑胺的耐药性,而外源性补充GSH可削弱替莫唑胺对耐药细胞的毒性作用。结论:间歇TMZ浓度递增法成功建立人胶质母细胞瘤耐药性细胞株U251TR和U87TR。Nrf2依赖的GSH净生成与TMZ耐药性形成相关。