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为提高外源基因进入细胞核的效率,设计合成了序列为KKKKKKKKKKKKACDCRGDCFCGPKKKRKV的多功能肽载体--K12RNLS。该肽载体由能识别细胞膜上整合素(integrin)受体的RGD(Arg-Gly-Asp)三肽基序、识别核膜上核孔复合体(nuclear porecomplexes,NPC)的核内化信号(nuclear localization signal,NLS)序列以及可增加与DNA结合的12个赖氨酸残基三个部分组成。将此肽载体与质粒DNA在溶液中混合,带正电荷的K12RNLS与带负电荷的DNA通过静电作用,能自发形成肽-DNA复合物。0.5μg质粒与不同量的K12RNLS在20μL无血清培养液中混合,室温静置20min后,经1%琼脂糖凝胶电泳分析,DNA/肽(质量比)=1∶2.2时达完全阻滞(此比例称为1阻滞单位)。在电镜下观察,其中按2阻滞单位(DNA/肽=1∶4.4)配制所形成的复合物,其颗粒直径大部分在20~50nm左右。 将所构建的含绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)报道基因的质粒pIRGFP与K12RNLS按一定比例配制待转染复合物。室温静置20min后,将K12RNLS-pIRGFP复合物转染(transfect)体外培养细胞。48h后,在荧光显微镜下观察,可见到表达绿色荧光蛋白的阳性细胞。其中2阻滞单位配制的复合物转染效果最好。 将含β-半乳精苷酶(β-lactase Z gene,LacZ)报道基因的质粒pCDLacZ与K12RNLS也按一定比例配制,室温静置20min后,将K12RNLS-pCDLacZ复合物于实验鼠胫前肌注射。4天后采取胫前肌,将其固定、染色。胫前肌经染色后,在其肌束膜及其附近的肌纤维膜可见被染成蓝色。 通过本研究初步证明,所设计合成的K12RNLS肽,具有一定的转运外源基因进入细胞核、并能使其得到有效表达的功能。