论文部分内容阅读
研究背景：Notch信号通路是一条进化上十分保守的信号转导系统。在无脊椎动物和脊椎动物发育过程中,Notch信号对细胞命运的决定起关键作用。通过Notch受体的信号传递能够扩大并固化相邻细胞之间的分子差异,最终决定细胞的命运。但大部分情况下它并不是独立地发挥作用,而是与Wnt等信号通路通过大量的“串话”(crosstalk)相互协同对细胞的发育、生长及凋亡起着重要的调控作用。Wnt通路是调控细胞增殖和分化的重要途径,它参与了胚胎发育的几乎全部过程,并在其中扮演了非常重要的角色。对Notch及其相关信号通路的研究对于以干细胞为中心的组织工程以及相关疾病如阿尔茨海默病、肿瘤的治疗和预防都有重要的意义。Wnt与Notch信号通路之间的crosstalk以前被认为主要发生在两个水平上:一个水平是Wnt蛋白可以结合在Notch的胞外结构域上,结果抑制了Delta与Notch的结合。另一水平是Wnt信号通路中的Dishevelled蛋白可以结合到Notch胞内结构域的羧基端上,通过稳定Notch非活化的构象来阻断Notch信号通路。最近的一些新的发现表明,Wnt与Notch通路之间有可能还存在着第三个水平上的crosstalk,早老素参与其中,但其具体作用机制还不是十分清楚。本实验中,我们通过转染Notchl绿色荧光蛋白表达载体,上调胚胎干细胞中Notchl的表达,研究了Notch、Wnt信号通路相关分子的表达变化,旨在进一步探讨Notch信号通路与Wnt信号通路间相互作用可能的分子机制,使我们对细胞发育中复杂的信号网络有更新的认识,从而进一步了解某些疾病的发病机制,有益于今后更好地诊断与治疗这些疾病。 实验方法：无菌条件下从小鼠胚胎组织中分离培养成纤维细胞,用H-DMEM培养液在37℃,5％CO2的条件下培养。培养到第2代时,用丝裂霉素处理成纤维细胞。将胚胎干细胞(Embryonic stem cells ESCs)复苏并接种在处理好的滋养层细胞上,用条件化培养基(包括0.071gβ-巯基乙醇,1ml非必需氨基酸,0.011g丙酮酸钠,15％胎牛血清)相同条件下培养。待干细胞状态稳定时,采用阳离子脂质体转染法将Notch1绿色荧光蛋白表达载体Notch1-PEGFP-C1转入小鼠胚胎干细胞,细胞分3组:Notch1-PEGFP-C1质粒转染组、PEGFP-C1空质粒转染组和正常对照组。转染24h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达;转染48h后收集纯化的ESCs,RT-PCR检测Notch1、HES-1、PS-1和GSK-3β基因水平表达情况,采用单因素方差分析各组间差异。 实验结果：1.转染效果的检测——转染后24h转染组和空转组在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达,转染后48h RT-PCR结果显示三组细胞均有Notch1 mRNA的表达,但转染组扩增条带比空转组和对照组暗。PCR定量分析软件及SPSS10.0统计分析软件对所得数据分析结果表明:转染组Notch1 mRNA的表达量明显高于空转组和正常组(p<0.05 n=5),同时Notch信号下游直接效应分子HES-1mRNA的表达变化与Notch1相似,充分说明用Notch1-PEGFP-C1转染ESC成功上调了Notch1 mRNA的表达;2.Notch1上调后GSK-3β、PS-1的变化—转染后48h RT-PCR结果显示GSK-3β、PS-1在各组ESCs中均有表达;转染组GSK-3β的扩增较空转组和正常组暗,统计学分析结果表明转染组GSK-3βmRNA表达量较其余两组显著升高(p<0.05 n=5);三组细胞之间PS-1扩增条带明暗度相似,统计分析表明其表达情况在三组之间并无显著差异(p>0.05 n=5)。 结论：1.转染Notch1后ESCs中的Notch信号通路转导增强。2.Notch信号途径增强后可以通过串话抑制Wnt信号通路。3.PS1在两个通路的串话中可能起到传递信号的作用,其自身的表达在mRNA水平并不发生改变。