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骨形成蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)是一个重要的生长因子,对胚胎早期骨骼、神经、造血系统的形成和各器官的分化发育具有重要作用。本研究通过物种间基因相似性比对,在保守区域设计多对引物,分别于mRNA水平和基因组水平上克隆并鉴定了鸭BMP4基因的核酸序列,并进行了序列分析、蛋白质结构功能预测、进化分析、基因组结构分析、SNP筛查等研究,主要结果如下:
1、参照人、小鼠与鸡BMP4基因的mRNA序列,采用同基因序列相似性比对并根据保守区域设计引物,克隆并鉴定了鸭BMP4基因cDNA序列,长度为1256bp,其中1212bp编码序列提交GenBank收录,登录号为EF540749。
2、鸭BMP4基因cDNA序列分析发现:5’非翻译区为44bp,编码序列为1212bp,编码404个氨基酸。核酸同源性分析发现,该基因与人、小鼠、鸡等同源基因相似性分别为78.8%、78.3%和95.5%。
3、对该基因编码的氨基酸序列、结构和功能进行生物信息学分析,结果显示:它与人、小鼠和鸡的BMP4同源性分别为83.8%、84.1%、96.2%;该蛋白15~34位氨基酸间存在一信号肽位点;符合TGF-β蛋白家族特点,7个特征半胱氨酸的位置固定;成熟肽氨基酸序列高度保守,各物种同源性均达到98%以上。
4、参照鸡BMP4基因的基因组结构,根据鸭BMP4基因的已知cDNA序列,设计特异性引物,克隆了该基因的1个内含子。内含子1长961bp,将其和外显子合成基因组序列提交GenBank收录,登录号为EF540750。
5、以北京鸭、三水白鸭等13种地方鸭群的基因组为模板,对各个品种的PCR产物直接测序,比较、分析测序结果后发现:在内含子上共发现13个SNP位点,在外显子上4个,其中1个是T247A(Ser→Arg);另3个为A328C、G1474A、C1786T。13个群体中各SNP位点的分布差别较大。
6、系统进化分析15个物种的BMP4氨基酸序列,发现鸭与鸡的同源性最高,列为同一分支,禽类与两栖类、鱼类聚类成一大组;而人、恒河猴、兔和狗,小鼠、大鼠和牛分别聚类成另两大组。该分析结果与理论上的物种进化顺序基本一致。