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根据GenBank公布的隐孢子虫SSU rRNA基因序列设计一对引物，并以标准基因组DNA为模板，初步建立检测奶牛隐孢子虫的基于SYBR Green的Real-Time PCR方法，对奶牛微小隐孢子虫(c．parvum)和安氏隐孢子虫(C．andersoni)阳性样品和40份奶牛粪便进行检测。结果显示，此次建立的Real-Time PCR对C．parvum和C．andersoni均能扩增出曲线，且其他寄生虫(鸡贝氏隐孢子虫、弓形虫、新孢子虫)和大肠杆菌均未检测到；标准基因组DNA的检测阈值达到5个拷贝，牛粪中卵囊的最低检测量为5个，克粪便，用建立的Real-Time PCR法对上海40份奶牛粪便进行检测，结果奶牛粪便阳性率为15％(6/40).本研究建立了快速、特异、敏感的隐孢子虫荧光定量PCR检测方法、，可用于奶牛隐孢子虫流行病学调查。