【摘 要】
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糖苷酶亦称糖苷水解酶(EC3.2.1.-),是作用于各种糖苷或寡糖苷键水解的酶类的总称.α-糖苷酶(EC 3.2.1.20)为淀粉水解酶类中的一种,他可以从多糖的非还原末端水解底物的α-1,4
【机 构】
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江南大学生物工程学院,教育部工业生物技术重点实验室,江苏无锡,214122
【出 处】
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华东六省一市生物化学与分子生物学会2015年学术交流会
论文部分内容阅读
糖苷酶亦称糖苷水解酶(EC3.2.1.-),是作用于各种糖苷或寡糖苷键水解的酶类的总称.α-糖苷酶(EC 3.2.1.20)为淀粉水解酶类中的一种,他可以从多糖的非还原末端水解底物的α-1,4-糖苷键产生游离的葡萄糖,并且广泛存在于微生物,植物和动物之中.本实验将竹黄菌Shiraia sp. SUPER-H168固态发酵所得的固态基质进行粉碎，用pH 7.0的磷酸盐缓冲液在4℃下浸提12h，经过滤和离心后将上清液进行冷乙醇沉淀蛋白，复溶后经由阴离子交换层析和凝胶过滤层析得到电泳纯的α-糖苷酶。纯化倍数为12.90,酶活力回收率为34.19％，比活力为1598.66 Umg-1.
对α-糖苷酶的酶学性质进行研究:以α-pNPG为底物时，最适反应温度为60℃,最适pH4.5，与对照组相比，10mM的SDS,Fe2+,Cu2+和Ag+分别抑制到0.71%,7.58%,26.00%和6.23%,Fe3+和Mg2+分别增加酶活至116.98%和142.27%,α-糖苷酶的Km,Vmax和kcat/km分别为0.52mM,3.76Umg-1，和1.3x104Ls-1mol-1.
胰蛋白酶作用后进行质谱分析，得到GSPYESASHGVYYR和WASVAEASR两条肤段，由此设计简并引物，利用PCR, RT-PCR以及RACE技术克隆得到α-糖苷酶的DNA和cDNA序列，并对序列进行分析。基因序列中有长度为2997bp的阅读框，编码998个氨基酸，其中有一条22个氨基酸组成的信号肤，序列中含有一个长度为48bp的内含子:预测蛋白分子量为108.2kD，等电点大约为5.08;氨基酸序列与其它真菌α-糖苷酶相似度不高，与Bipolaris maydis C5的相似度最高为76%;氨基酸序列中有9个潜在的糖基化位点( Asn-Xaa-Ser/Thr)和14个活性位点，其中包含两个催化位点;进化树分析说明竹黄菌α-糖营酶属于子囊菌α-糖苷酶。
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