【摘 要】
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筛选并分析转染Islet-1慢病毒载体的MSCs转化为心肌样细胞过程中与Islet-1相互作用的乙酰化酶(HATs)或去乙酰化酶(HDACs),明确Islet-1在C3H10T1/2分化为心肌样细胞乙酰化调控
【机 构】
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重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所; 重庆医科大学附属儿童医院心脏内科;
【基金项目】
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国家自然科学基金(30973219);重庆市自然科学基金重点项目(CSTC,2009BA5084)
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筛选并分析转染Islet-1慢病毒载体的MSCs转化为心肌样细胞过程中与Islet-1相互作用的乙酰化酶(HATs)或去乙酰化酶(HDACs),明确Islet-1在C3H10T1/2分化为心肌样细胞乙酰化调控网络中的关键枢纽作用。免疫荧光和免疫印迹检测Islet-1表达的部位和最高表达时间点,以确定免疫共沉淀核蛋白提取时间。免疫共沉淀技术(Co-IP)沉淀与lislet-1结合的蛋白。高效液相色谱芯片纳流电喷雾串联质谱联用技术(HPLC-CHIP-NanoSpray-ESIMS/MS)鉴定与Iislet-1结合的蛋白,利用ExpAsy、EMBL-EBI和Intact数据库对上述质谱结果进行生物信息学分析和筛选。免疫印迹验证筛选出的乙酰化和去乙酰化相关蛋白。免疫细胞荧光结果表明,诱导组Islet-1在胞浆胞核均有表达。Western Blotting结果表明,诱导组Islet-1表达量在诱导后3周表达量最高。免疫共沉淀技术可行性分析表明,阳性对照组有Islet-1蛋白表达,实验组有Islet-1蛋白表达,对照组无Islet-1蛋白表达,实验组排除非特异性结合后的条带为质谱分析条带,利用HPLC-CHIP-NanoSpray-ESI-MS/MS鉴定质谱分析的条带。通过Co-IP-SDS-PAGE-MS/MS鉴定和生物信息学分析获得Islet-1复合体组分为:(1)促进干细胞向心肌细胞方向分化相关因子(2)转录因子-DNA结合蛋白(3)信号转导蛋白。Co-IP-SDS-PAGE-MS/MS鉴定和生物信息学分析获得与Islet-1相互作用的HATs和HDACs复合体,验证了Islet-1募集蛋白复合体具有调控干细胞分化乙酰化的生物学功能。
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