【摘 要】
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以PCR方法扩增得到弗氏柠檬酸细菌(Citrobacter freundii)ATCC 8090中酪氨破酚裂解酶的结构基因tpl,与带强启动子T5的表达载体pQE30T连接后构建质粒pQTTPL,并转化到E.coli M1
【机 构】
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江南大学教育部工业生物技术重点实验室
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以PCR方法扩增得到弗氏柠檬酸细菌(Citrobacter freundii)ATCC 8090中酪氨破酚裂解酶的结构基因tpl,与带强启动子T5的表达载体pQE30T连接后构建质粒pQTTPL,并转化到E.coli M15中进行表达,所表达的酶经镍亲和柱HiTrap、Sephadex G-75凝胶过滤、凝血酶切除组氨酸标签后再通过镍亲和柱HiTrap三步纯化后,得到SDS-PAGE单一谱带的纯酶,比酶活3.32U/mg,该酶最适pH 7.8,最适温度30℃,在40℃以下和pH7.0-8.4之间保持较好的稳定性,Fe2+、Mg2+对酶有明显的激活作用,Ba2+、Pb2+、Mn2+、Ni2+、Sn2+、Co3+、Cu2+对酶活有不同程度的抑制作用.而K+和Ca2+的作用可以忽略不计,以L-酪氨酸为底物时,该酶的Km和为Vmax分别为0.25 mmol/L和2.39μmol/(mg·min)。
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