【摘 要】
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目的：构建一种含H5N1禽流感病毒全长HA/NA/M基因的重组质粒,并为病原学检测提供阳性定量标准品。方法：设计H5N1禽流感病毒HA、NA及M抗原基因全长开放阅读框的克隆引物,提取H5N1
【机 构】
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南京军区军事医学研究所,南京210002
【出 处】
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江西省科协第二届学术年会暨华东地区第十一次流行病学学术交流会议
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目的：构建一种含H5N1禽流感病毒全长HA/NA/M基因的重组质粒,并为病原学检测提供阳性定量标准品。方法：设计H5N1禽流感病毒HA、NA及M抗原基因全长开放阅读框的克隆引物,提取H5N1禽流感病毒总RNA后用RT-PCR获得相应片段,用三次酶切连接的方法,依次插入到pCEM-T easy质粒,再进行测序。线性化后的重组质粒用T7 RNA聚合酶进行体外转录。对RNA转录产物纯化后测定浓度,用实时荧光定量PCR构建标准曲线进行验证。结果：RT-PCR扩增片段与预期片段大小相符,构建的重组质粒PG EM-HA-NA-M插入片段的测序结果与GenBank公布序列一致。由重组质粒体外转录获得同时含H5N1禽流感病毒HA、NA、M全长开放阅读框序列的RNA片段,质量浓度为395.6 ng/μl,可准确定量拷贝数,梯度稀释后用实时荧光定量PCR获得了良好的标准曲线。结论：成功构建重组质粒PGEM-HA-NA-M,由此质粒体外转录获得的RNA片段可作为H5N1禽流感病毒核酸快速检测方法的阳性定量标准品。
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