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背景：子宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,发病率在女性恶性肿瘤中居第二位.据世界范围内统计,每年大约有50万左右的宫颈癌新发病例,其中80％的病例发生在发展中国家.我国每年有新发病例约13.15万,占世界宫颈癌新发病例总数的28.8％.近10余年来以大规模人群为基础的流行病学资料显示：在99％以上的宫颈癌中存在人乳头瘤状病毒(HPV)DNA,HPV感染是宫颈癌发生的首要因素且为始动因素.由于几乎所有宫颈癌细胞中都有HPV DNA和病毒转化蛋白的表达,HPV病毒蛋白可作为一种抗原刺激机体产生针对HPV的免疫反应,这就促使人们希望通过疫苗的方法来治疗和预防宫颈癌.由于各型HPV之间没有交叉保护作用而HPV基因型的分布又存在地域差异,目前尚无关于广西地区宫颈癌HPV感染分子流行病学的详细及疫苗构建的报道.目的：为使本地区疫苗研制更具有针对性,我们首先对广西地区HPV感染情况、基因型分布以及高感染率的HPV基因型病毒负载量进行流行病学调查.随后,我们将构建和表达HPV5 8型DNA疫苗并检测该疫苗的免疫效果.方法：(1)应用凯普HPV核酸扩增分型检测试剂盒对515例广西宫颈癌患者的宫颈组织DNA进行21种HPV亚型的检测；并应用实时荧光定量PCR对HPV16、18和58型阳性样本各50、48和41例的病毒负载量进行了绝对定量检测.(2)为消除HPV58 E6、E7基因的转化活性以保证疫苗的安全性,定点突变E6第50、63和106位,E7第24、26和92位氨基酸,将E6和E7融合表达,突变修饰后的基因命名为HPV58mE6E7.经软琼脂集落形成和裸鼠皮下成瘤实验检测HPV58mE6E7的转化活性.(3)将HPV58mE6E7融合基因片段插入真核表达载体pCI-Fc-GPI中,构建重组真核表达质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI.再将得到的sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI片段插入新型疫苗载体PVAX1-IRES-GM/B7中,构建PVAX1-HPV58mE6E7FcGB复合基因疫苗,流式细胞术及免疫荧光检测该疫苗的表达.(4)为检测该疫苗的免疫效果,还须构建携带HPVHPV58 E6和E7基因的成瘤细胞系及重组抗原.在构建重组真核质粒pIRES-neoHPV58E6E7后,利用阳离子脂质体转染及G418加压的方法筛选出稳定表达HPV58E6E7融合基因的B16细胞株—B16-HPV58E6E7.同时,在构建pET-42a(+)-HPV58E6E7原核质粒后,利用原核诱导及谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化回收的方法纯化出重组抗原—HPV58E6E7融合蛋白.(5)动物实验中,我们采用肌肉注射加在体局部电脉冲的方法,将PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗免疫用B16-HPV58E6E7细胞系成瘤的C57BL/6小鼠.后利用HPV58E6E7融合蛋白作为重组抗原,通过特异性抗体检测、酶联免疫斑点检测(ELISPOT)、细胞毒性杀伤实验观察该疫苗在被免疫小鼠体内诱发的体液和细胞免疫反应；通过抗肿瘤移植保护实验和肿瘤生长抑制实验观察该疫苗对小鼠抗移植瘤的效果.结果：(1)①检测的515例样本中473例HPV阳性,HPV总阳性率为91.84％.HPV16的阳性率最高,为81.40％；其次为HPV18(10.15％)；第三位是HPV58(8.67％).排在前五位的HPV亚型依次为HPV 16、18、58、52及31.②检测样本中HPV16、18和58型的病毒负载量几何均数分别为2.3985、0 0173、0.0381.HPV16分别与HPV18和58型的病毒负载量比较,差异有显著性(P＜0.05)；HPV18与58型的病毒负载量比较,差异无显著性(P＞0.05).(2)稳定表达突变后的HPV58mE6E7融合基因的NIH/3T3细胞系—3T3-HPV58mE6E7,在细胞集落形成实验中无细胞集落形成,在接种裸鼠后4周不形成肿瘤.(3)经酶切鉴定及测序分析证实PVAX1-H PV58mE6E7FcGB复合基因疫苗构建成功.流式细胞术及免疫荧光检测表明该疫苗中的融合抗原sigHPV58mE6E7-Fc-GPI及分子佐剂GM-CSF/B7.1能够同时实现真核表达.(4)经疫苗免疫后的小鼠,可诱发血清特异性抗体,抗体滴度最高可达1：25600,与对照组比较,差异有显著性(P＜0.05).ELISPOT可以检测到重组抗原HPV58E6E7融合蛋白诱导的特异性、分泌IFN-γ的效应T细胞,疫苗组小鼠ELISPOT的斑点数明显多于对照组(P＜0.05),通过LDH法,我们还检测到该疫苗特异性CTL反应率最高达45％.在抗肿瘤移植保护实验中,疫苗组小鼠皮下接种的成瘤潜伏期时间长于对照组(P＜0.05).在肿瘤生长抑制实验中,疫苗组小鼠肿瘤生长速度较对照组明显减慢,最终使小鼠生存期延长,平均瘤重低于对照组(P＜0.05).结论：(1)广西宫颈癌患者中HPV16感染率排在首位,HPV18和58虽然分列第二、三位,但感染率明显低于HPV16.并且HPV16的病毒负载量也远远高于HPV18和58,说明HPV16的高病毒负载量与其高阳性率可能存在一定关系.(2)成功构建并表达PVAX1-HPV58mE6E7FcGB复合基因疫苗,并通过动物实验证实该疫苗能激发特异性的体液及细胞免疫反应,显著抑制B16-HPV58E6E7肿瘤细胞的生长,可作为HPV58阳性相关肿瘤及其癌前病变免疫治疗的候选疫苗.