【摘 要】
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根据GenBank公布的Japanese Encephalitis Virus(JEV)SA14-14-2减毒株的核苷酸序列(GenBank登录号:AF315119),设计并合成一对特异性引物.应用RT-PCR方法扩增出编码JEV囊膜蛋
【机 构】
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南京农业大学农业部畜禽疫病诊断与免疫重点实验室(江苏南京)
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根据GenBank公布的Japanese Encephalitis Virus(JEV)SA14-14-2减毒株的核苷酸序列(GenBank登录号:AF315119),设计并合成一对特异性引物.应用RT-PCR方法扩增出编码JEV囊膜蛋白抗原域Ⅲ的基因(Em),将其克隆入pMD18-T载体,经测序后克隆入原核表达载体pET-32a(+),构建原核表达载体pET-Em.阳性质粒转化BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导,JEV-Em基因获得表达,经细胞定位分析,目的蛋白以包含体的形式存在于大肠杆菌中.通过改变IPTG的浓度和诱导时间,确定了表达Em蛋白的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.1mmol L<-1>,诱导时间为3h,在大肠杆菌中的最高表达量为54.9﹪.Western blot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性.利用纯化的表达产物作抗原包被酶标板,可以明显的区分JEV阴阳性血清,并且不与PRV、CSFV、PRRSV、PPV、PCV的阳性血清发生反应,结论:重组JEV Em蛋白可以用于检测猪血清中JEV抗体水平.
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