论文部分内容阅读
目的：探讨MMP-12参与肺损伤无效重建以及与早期肺纤维化启动之间的内在联系,阐明放射性肺纤维化发生机制；探讨吡啡尼酮(Pirfenidone)对肺损伤异常重建的对抗作用.方法：应用基因芯片技术筛选放射性肺损伤早期动物肺组织纤维化相关基因表达的时相关系；应用明胶酶谱分析、Western Blot和免疫组化技术检测60Co射线照射后大鼠肺内MMP-12活性和蛋白表达变化；应用组织特殊染色法观察肺泡壁弹力纤维降解断裂情况；用透射电镜观察肺泡Ⅱ型上皮细胞与肺泡间隔巨噬细胞和成纤维细胞间的"信号交流(cross talking)"现象,用ELISA检测肺纤维化相关因子TGF-β、IL-1β、TNF-α的表达变化,用免疫组化检测肺组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达；原代分离大鼠肺泡Ⅱ型细胞(AT-Ⅱ)、肺间质巨噬细胞(MA)和成纤维细胞(Fb),应用酶谱分析检测培养细胞上清中MMP-12的活性；培养的人肺成纤维细胞(HLF)经60Co射线照射后用不同剂量的吡啡尼酮进行处理,应用免疫细胞化学、Western Blot、MTT比色法和酶谱分析法分别检测HLF中TGF-β1、α-SMA、TNF-α、IL-1β、IFN-γ的表达变化和细胞异常增生程度以及细胞上清中MMP-12的活性.结果：(1)基因芯片筛选显示,肺组织中MMP-12活性在60Co射线照射后1周开始增高,3周达高峰,4周开始下降；镜下特染发现肺泡壁基底膜弹力纤维于照射后1周开始出现降解和断裂,4周时最为严重；肺组织TGF-β1含量和α-SMA免疫组化阳性信号在1～4周内随照后时间延长而进行性升高；电镜观察发现,肺泡Ⅱ型上皮细胞与肺泡隔间质细胞之间出现"信号交流"现象.(2)在动物试验水平上,吡啡尼酮能明显减轻照射后肺组织的增生性炎症和病变程度,显著抑制照射引起的MMP-12蛋白表达和酶活性升高,与此同时明显减轻肺泡基底膜弹力纤维的降解断裂,抑制Ⅱ型细胞与间质细胞的"Crosstalking"生物反应以及由此引起的纤维化相关因子的释放,拮抗肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化.(3)在细胞水平上,吡啡尼酮能明显下调照射后肺实质细胞(AT-Ⅱ)和间质细胞(MA、FB)培养上清中MMP-12的酶活性,抑制HLF表达TGF-β1、α-SMA、TNF-α、IL-1 β、IFN-γ和对抗成纤维细胞异常增生的作用,此种抑制作用与给药剂量呈明显依赖关系.结论：1.在放射性肺损伤早期,激活的巨噬细胞过高表达MMP-12,导致肺泡壁基底膜弹力纤维降解断裂,诱发Ⅱ型细胞与肺泡间隔巨噬细胞和成纤维细胞及内皮细胞相互接触,产生细胞间cross talking生物反应,导致纤维化相关因子的表达,刺激成纤维细胞活化、增生,向MFb方向转化,合成过多的Ⅳ、Ⅰ、Ⅲ型胶原,沉积于肺间质,最终形成肺纤维化；2.MMP-12为早期放射性肺纤维化启动的一个关键靶点；吡啡尼酮通过对MMP-12表达及酶活性的抑制,可成为一种对抗放射性肺纤维化发生的新型制剂.