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目的 2005年,数个研究小组报道在Ph染色体阴性的骨髓增殖性疾病患者中广泛存在一种JAK2基因14外显子点突变(1849G→T)即JAK2 V617F,可导致EPO受体信号通路出现紊乱.由于该发现,2008年WHO在其第四版诊断标准中正式将红细胞增多症(PV)、原发性骨髓纤维化(PMF)、原发性血小板增多症(ET)及嗜酸细胞增多症(HES)等系列疾病命名为骨髓增殖性肿瘤(MPNs),并将该突变列入了疾病的诊断标准.本实验借鉴低温变性共扩增(COLD PCR)的技术路线,以建立一种新型聚合酶链式反应温度体系,在基因扩增过程中富集突变的目的片断,使突变比例低于1％的核酸得以选择性扩增,从而提高检测的灵敏度以帮助临床进行早期诊断.方法 以人红白血病细胞株HEL为突变阳性对照,人结肠癌细胞株SW480为野生对照,使用传统PCR方法扩增目的片断,经高分辨熔解(high Resolution melting,HRM)分析,优化分析条件后得到产物Tm,选择Tmn-2℃～Tm为变性温度进行梯度PCR,最终确定能特异性扩增突变序列的最低变性温度79.1℃为Tc.采用不对称PCR反应试剂体系,同时加入C3封闭的非标记探针,以Tc为变性温度扩增20循环后升高变性温度至94℃再次扩增30循环,产物以HRM分析.将等浓度的野生型核酸梯度稀释突变核酸进行检测,探得最低检出限.同时评估该实验批内、批间重复性,建立COLD PCR非标记探针高分辨率熔解(COLD-Unlabeled-HRM)分析体系.选取临床符合2008WHO诊断标准的MPNs200例,留取EDTA抗凝血,独立进行3次DNA抽提,分别以传统HRM与COLD-Unlabeled-HRM进行扩增检测,结果以T-A克隆测序鉴定.结果 COLD-Unlabeled-HRM体系最低检出限为0.3％.野生与突变探针Tm的变异系数为：0.03％、0.03％(批内)和0.17％、0.27％(批间).采用传统HRM法检测PV、ET与PMF病例临床标本突变阳性率分为89％(68/76)、46％ (37/79)、58％ (18/31)；采用COLD-Unlabeled-HRM法检测PV、ET与PMF病例临床标本突变阳性率分为92％ (70/76)、51％(41/79)、58％(18/31),与文献报道相符.对于传统HRM未检出突变而COLD-Unlabeled-HRM检测阳性的2例PV与4例ET样本,经T-A克隆测序验证,确实存在仅可以COLD PCR富集的痕量突变.结论 本研究成功地将低温变性富集突变核酸的技术与非标记探针HRM相结合,对外周血中的痕量JAK2V 617F突变实施灵敏、准确的检测,且全部检测可在3小时内完成、价格低廉,可满足临床对低浓度突变筛查的需要.