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目的:应用RAb1 siRNA处理大鼠肺动脉平滑肌细胞(RPASMCs),观察低氧处理后RPASMCs的表型转化以及血管紧张素Ⅱ1型受体(ATIR)对其表型转化的影响,探讨RAb1在RPASMCs表型转化中的作用,为低氧肺血管重建的治疗提供有益的借鉴.
方法:采用肺内动脉组织贴块法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞,通过倒置显微镜观察培养细胞特征性的形态,并使用特异性的A-SM抗体进行免疫荧光染色鉴定.将未转染及转染RAb1 siRNA慢病毒颗粒后的RPASMCs接种到6孔板中,培养24h后放入低氧(3％O2)细胞培养箱继续培养24h、48h、72h,并使用常氧处理组作为对照.将未转染的细胞和Rab1 siRNA慢病毒颗粒转染后的细胞根据实验分组情况加入Ang Ⅱ(终浓度为100nM ),AT2R特异性拮抗剂PD123319(终浓度为luM), AT1R特异性拮抗剂ZD7155(终浓度为100nM )，具体分组为:正常细胞常氧组、正常细胞低氧处理(3% O2)组、正常细胞低氧处理+Ang Ⅱ(终浓度为100nM)组、转染Rab1 siRNA细胞低氧处理组、转染Rab1 siRNA细胞低氧处理+Ang Ⅱ(终浓度为100nM)组、转染Rab1siRNA细胞低氧处理+Ang Ⅱ(终浓度为100nM) +PD123319(终浓度为luM),转染Rab1 siRNA细胞低氧处理+Ang Ⅱ(终浓度为100nM)+ZD7155(终浓度为100nM)组。放入低氧细胞培养箱继续培养48h。应用Western Blot检测各组细胞血管平滑肌细胞标志分子(A-SMA和VIM)的表达情况。
结果:组织块法培养RPASMCs的鉴定结果显示:相差显微镜下，原代培养的细胞呈梭状，并呈峰谷分布生长，抗A-SMA抗体间接免疫荧光化学染色呈阳性。RPASMCs中A-SMA和VIM的表达随着低氧处理时间的延长逐渐减少，低氧处理24 h,48 h,72 h后的RPASMCs细胞中的A-SMA仅为对照组的0.82±0.07,0.80±0.08、0.83±0.06, VIM仅为对照组的0.79±0.06、0.77±0.05、0.75±0.06(P<0.05)。经低氧处理48h后，正常细胞低氧处理组、正常细胞低氧处理+Ang Ⅱ组、转染Rab1 siRNA细胞低氧处理组、转染Rab1 siRNA细胞低氧处理+Ang Ⅱ组、转染Rab1 siRNA细胞低氧处理+AngⅡ+PD 123319组、转染Rab1 siRNA细胞低氧处理+AngⅡ+ZD7155组的A-SMA和VIM分别为正常细胞常氧组0.85±0.04、0.69±0.08、0.87±0.04、0.77±0.03、0.77±0.07、0.92±0.04和0.80±0.02、0.67±0.05、0.83±0.06、0.76±0.03、0.81±0.03、0.94±0.03。RPASMCs经低氧刺激后，细胞表型蛋白标志分子(A-SMA,VIM)可减少，细胞在低氧状态下，加入AngⅡ后，A-SMA和VIM进一步减少，但转染Rab1 siRNA后的细胞减少的幅度明显减少，加用AT1R特异性阻滞ZD7155后，A-SMA和VIM减少的幅度进一步减少(P<0.05)。
结论:低氧及Ang Ⅱ可引起RPASMCs分化表型标志蛋白表达的减少，使RPASMCs表型由分化表型转变为去分化表型。使用Rab1 siRNA或AT1R特异性受体阻滞剂后可以部分阻止RPASMCs的表型转化。Rab1蛋白参与低氧诱导的RPASMCs由分化表型向去分化表型的转化。