论文部分内容阅读
目的：从健康中国人外周血单个核细胞中克隆人类MxA基因，应用腺病毒载体系统AdEasy system构建重组腺病毒质粒pAdMxA。研究重组腺病毒AdMxA体外抗HBV作用效果，为后续体内实验研究提供实验和理论基础。
方法：从健康中国人外周血单个核细胞中提取总RNA，以总RNA为模板，根据GenBank中的MxA序列设计合成扩增MxA基因的特异性引物，进行RT-PCR反应扩增出目的基因。目的基因经纯化后定向克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV，构建重组质粒pAdTrack-MxA，选取鉴定正确的克隆测序。扩增重组质粒pAdTrack-MxA，碱裂解法提取质粒，以Pme I酶切使之线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内进行同源重组以构建重组腺病毒质粒pAdMxA。重组腺病毒质粒oAdMxA经卡那霉素抗性鉴别和PacI酶切确证，然后将pAdMxA以PmeI线性化后转染入293细胞中包装成完整的重组腺病毒颗粒AdMxA，观察绿色荧光蛋白的表达并检测重组腺病毒AdMxA的感染滴度。进一步以重组腺病毒AdMxA的不同MOI转染HeoG2.2.15细胞，利用RT_PCR方法检测HepG2.2.15细胞内.MxA Mrna水平的表达。以重组腺病毒AdMxA的不同MOI转染HepG2.2.15细胞，利用ELASE方法检测HepG2.2.15细胞内HBsAg、HBeAg水平的变化。
结果：测序结果表明本实验从健康中国人PBMC中所克隆出的MxA基因，其序列与GenBank中人MxA基因序列同源性达99.75％，仅有5个碱基不同，且所编码的氨基酸仅1个发生改变，此氨基酸位于MxA蛋白的非功能区。所构建的重组腺病毒质粒pAdMxA经Pac I酶切后可见一条约4.5kb和另一条约30kb的条带，表明同源重组成功。重组腺病毒质粒pAdMxA经293细胞包装后可观察到绿色荧光，收获病毒并测定感染滴度为1.59×10s(pfu/ml)，具有较高感染效率。HepG2.2.15细胞经重组腺病毒AdMxA转染后，RT-PCR显示胞内MxA Mrna水平均较未转染对照组明显升高；胞内HBsAg、HBeAg水平均较未转染对照组明显降低，有统计学意义(P<0.05)。
结论：成功克隆了中国人MxA基因，并成功构建重组腺病毒AdMxA，重组腺病毒AdMxA感染靶细胞HepG2.2.15后其MxA Mrna表达水平明显升高，并能显著抑制HepG2.2.15中HBV的复制。以上表明重组腺病毒AdMxA有望成为一种有效的基因治疗方法。