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日粮蛋白质在瘤胃微生物所分泌酶的作用下,被逐步分解成寡肽、二肽、氨基酸和氨,氨容易被瘤胃吸收并排泄.过量氨的产生导致日粮蛋白利用率和微生物蛋白合成效率降低,而寡肽降解为二肽的过程是肽降解的第一步.二肽基肽酶Ⅳ (Dipeptidyl peptidase Ⅳ,DPP-Ⅳ,EC 3.4.14.5)作为寡肽降解的关键酶,研究其基因特征和酶学性质,有助于寻找抑制靶点,降低二肽的生成速度,进而降低氨生成,有利于提高氮的利用效率.采用元基因组学的序列筛选方法研究瘤胃微生物DPP-Ⅳ的序列特征和酶活性.选取瘤胃微生物Fosmid文库中17 664个克隆,通过筛选池的方法,利用dpp-Ⅳ简并引物筛选含dpp-Ⅳ的阳性克隆.提取阳性克隆的质粒,用限制性内切酶HindⅢ进行酶切,然后对阳性克隆的Fosmid末端进行测序.PCR扩增阳性克隆的保守区,进行克隆测序,利用Bioedit软件对序列进行比对.提取阳性克隆胞内蛋白液,利用底物Gly-Pro-pNA检测阳性克隆的肽酶活性.从瘤胃微生物Fosmid文库中通过序列筛选获得10个含有dpp-Ⅳ的阳性克隆(命名为DP1-DP10),HindⅢ酶切图谱表明筛选得到了10个不同的阳性克隆.Fosmid末端序列经blastx比对后发现其与数据库的匹配度较低,其中DP8F和DP10R的末端序列分别与Prevotella ruminicola 23和Muricauda ruestringensis的DPP-Ⅳ相似性达到78％和60％.对8个阳性克隆序列比对后,发现均含有DPP-Ⅳ保守区域(DWVYEEE)和C端催化区域.C端催化区域存在3种类型,其中DP2、DP8和DP10的催化区域为GWSYGG、DP4和DP6为GWRYGG,DP3、DP5和DP7为GWTYGG.经blastp比对,发现DPP-Ⅳ与Cyclobacterium marinum、Capnocytophaga sp.、Prevotella ruminicola 23和Solitalea canadensis来源的DPP-Ⅳ相比,相似度较高(43％ ～81％).经酶活力检测,发现DP7肽酶活力最高,为6.88 U/mg,依次是DP6和DP5,DP2最低.结果提示本文从瘤胃Fosmid文库17 664个克隆中获得了10个含有dpp-Ⅳ的阳性克隆,它们具有不同的基因特征和酶活力大小,暗示DPP-Ⅳ某些氨基酸残基的替换会抑制酶活力.下一步将通过dpp-Ⅳ定点突变结合酶活力检测的方法,寻找与酶活力显著相关的某些氨基酸残基.