β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)是一种重要的工业应用酶.它同时具有二糖水解和合成活性,既能水解寡糖、二糖生成相应的单糖,又能利用单糖合成二糖.目前对于β-葡萄糖苷酶的研究方向主要集中在提高其水解活性上,而对其转糖基并合成二糖的活性研究相对较少.之前的研究表明,里氏木霉中β-葡萄糖苷酶可能通过转糖基活性在体内产生二糖从而诱导纤维素酶的生产,因此其体内的β-葡萄糖苷酶可能具有较高的二糖合成活性.我们因此选取了里氏木霉的β-葡萄糖苷酶Cel1b作为研究对象,试图进一步通过理性改造提高其二糖合成活性以获得高效合成二糖的β-葡萄糖苷酶.我们首先通过同源模建模拟得到了Cel1b蛋白的三维结构,然后将Cel1b蛋白和纤维二糖进行柔性对接,结果显示纤维二糖的第二个葡萄糖残基处于一个相对亲水的环境(如N240)中,而其周围仍存在部分疏水性氨基酸残基如W173,I174,I177.我们据此提出了一个假说：β-葡萄糖苷酶的转糖基活性与其二糖结合部位氨基酸的亲疏水性有关,结合部位的疏水性的降低可能有助于提高其转糖基活性.我们进一步通过点突变技术对Cel1b蛋白进行了定点突变,将其活性中心的疏水性氨基酸变为了亲水性的氨基酸,获得了I177S、I177S/I174S、I177S/I174S/W173H等三株活性中心亲水性逐渐增强的蛋白；并在原始蛋白基础上将亲水性氨基酸突变为疏水性氨基酸,获得了活性中心疏水性增强的蛋白N240I.我们通过对上述理性改造获得的四个蛋白质进行其二糖合成与水解活性的鉴定,发现其利用葡萄糖作为底物时可以合成昆布二糖、纤维二糖和槐糖三种二糖,当活性中心的亲水性增加时,其二糖合成活性增加,水解活性减弱；当活性中心的疏水性增加时,其二糖合成活性消失,而水解活性保持不变.其中,I 177S/I 174S/W173H突变蛋白的槐糖最大产量达到了25g/L.这一实验结果证实了我们前述Cel1b蛋白活性中心亲疏水性对二糖合成/水解活性影响的假说,并以此假说为出发点,通过理性改造获得了一株高效合成槐糖的β-葡萄糖苷酶.这为以后对β-葡萄糖苷酶进行定向改造及其催化机制的研究具有重要意义.