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目的：本研究的目的是通过体外细胞培养实验,研究六价铬暴露对人B淋巴母细胞系DNA总甲基化水平及p16基因启动子区DNA甲基化状态的影响,明确p16基因DNA甲基化在调控p16基因及蛋白表达中的可能作用及其在六价铬诱发细胞周期阻滞中的作用,从而为六价铬毒性机制的研究提供依据.
方法：分别用0,5,10,1SμM的KCr2P7和0,1.25,2.5,5μg/cm2的PbCrO4处理人B淋巴母细胞系,KCr2O7和PbCrO4的染毒时间分别为2h,24h与4h,24h.染毒结束后收集细胞,使用(Propidium Iodide,PI)荧光染料结合流式细胞仪技术检测细胞周期.提取细胞中的DNA、总RNA及蛋白质,用甲基化DNA定量检测试剂盒检测DNA总甲基化水平,用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)方法测定P16基因启动子区的DNA甲基化状态,用实时荧光定量PCR技术检测CDK4、CDK6及p16基因mRNA的表达水平,用Western Blot技术检测p16蛋白的表达水平.
结果：K2Cr2O7和PbCrO4短期(2h/4h)处理对人B淋巴母细胞系的细胞周期无明显影响.重铬酸钾和铬酸铅处理24h后,人B淋巴母细胞系各处理组G1期细胞数均显著高于对照组(P＜0.01),S期细胞数明显低于对照组(P＜0.05,P＜0.01),G2期细胞数均无显著改变.K2Cr2O7和PbCrO4处理均可降低人B淋巴母细胞系基因组DNA的总甲基化(5-mC％)水平,且呈一定的剂量效应关系,且在2h/4h处理组DNA总甲基化水平的降低程度比24h处理组更明显.MSP结果显示重铬酸钾和铬酸铅处理对p16基因的DNA甲基化无明显影响.人B淋巴母细胞系经K2Cr2O7和PbCrO4分别处理2h和4h后,p16、CDK4和CDK6基因的表达水平无明显改变.经5～15μM的K2Cr2O7处理24h后,人B淋巴母细胞系p16基因表达水平显著高于对照组(P＜0.01),CDK4和CDK6基因表达水平显著低于对照组(P＜0.05,P＜0.01).经PbCrO4处理24h后,人B淋巴母细胞系CDK6基因表达水平在2.5～5.0μm/cm2处理组降低,p16基因表达水平在1.25μg/cm2处理组升高,但各处理组CDK4基因的表达水平未发生改变.人B淋巴母细胞系在高浓度(15μM) K2Cr2O7处理组p16蛋白表达水平显著高于对照组(P＜0.05).
结论：可溶性和不溶性六价铬化合物处理24h均可致人B淋巴母细胞系发生G1期细胞周期阻滞,且其可能和p16基因表达上调、CDK4/6基因表达下调及DNA总甲基化水平降低有关,但六价铬化合物对人B淋巴母细胞系p16基因的上调作用并非通过DNA甲基化途径实现.