【摘 要】
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猪Delta冠状病毒(Porcine Delta Coronavirus,PDCoV)是一种能够引起仔猪腹泻的新型冠状病毒,2014年该病毒在美国的猪群中爆发并造成普遍流行,给健康养猪带来了严重的威胁.由于PDCoV是近年来新发现的一种冠状病毒,其病原学相关特性尚未完全解析,给预防和控制该病原的感染与流行增加了难度.PDCoV的N蛋白是相对保守且免疫原性较好的蛋白,在PDCoV的诊断上具有重要价值
【机 构】
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中国农业科学院上海兽医研究所,上海,200241
【出 处】
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2016第六届中国兽药大会(中国畜牧兽医学会动物药品学分会第五届全国会员代表大会暨2016学术年会、中国微生物学会兽医微
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猪Delta冠状病毒(Porcine Delta Coronavirus,PDCoV)是一种能够引起仔猪腹泻的新型冠状病毒,2014年该病毒在美国的猪群中爆发并造成普遍流行,给健康养猪带来了严重的威胁.由于PDCoV是近年来新发现的一种冠状病毒,其病原学相关特性尚未完全解析,给预防和控制该病原的感染与流行增加了难度.PDCoV的N蛋白是相对保守且免疫原性较好的蛋白,在PDCoV的诊断上具有重要价值,为此,本研究根据GenBank中登录的PDCoV Ohio 137(K J601780)的N基因设计一对特异性引物,以此前我们检测PDCoV为阳性的样品JSNT2的cDNA为模板,进行RT-PCR扩增获得大小约为1029bp的目的片段,利用引入的限制性内切酶XhoI/EcoRI对回收纯化的N基因进行双酶切后,将其克隆至pColdI原核表达载体上,经质粒PCR、双酶切和基因测序后,将鉴定正确的阳性质粒pCold-N转化于BL21感受态菌株中,在所获得的pCold-N阳性菌液中加入终浓度为1mM IPTG,于16℃低温诱导24小时后,收获诱导表达产物,经超声破碎后,进行SDS-PAGE电泳观察,结果显示表达的重组蛋白大小约为40KDa左右,与预期目标大小相一致,且该蛋白呈可溶性表达.利用PDCoV感染猪的阳性血清对表达的重组蛋白进行Western blot鉴定,结果显示该血清可以特异性识别pCold-N蛋白.利用His-tag磁珠对表达的重组蛋白pCold-N进行纯化,然后以纯化后的pCold-N作为抗原,免疫6-8周龄的Balb/c小鼠,3次免疫后取免疫鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合,同时采用pCold-N为包被抗原,对其分泌上清进行间接ELISA检测,对筛选获得的阳性细胞克隆株用有限稀释法进行克隆纯化.同时利用PDCoV感染后的ST细胞对其进行IFA检测,检测结果显示,单抗PCN-67能够识别PDCoV感染的ST细胞并产生特异性荧光.据此证实我们获得了一株能够稳定分泌针对PDCoV-N蛋白单克隆抗体的细胞株.及时监测PDCoV引发的疫情是防控该病的关键,本研究结果的获得为今后开展PDCoV的诊断工作提供了重要素材.
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犬细小病毒病是引起幼犬高度致死性传染病之一，严重危害养犬业健康发展。正确诊断犬细小病毒病对防制该病极为关键。本文就该病病原学诊断、血清学诊断、分子生物学诊断等方面展开阐述，以期弄清该病实验室诊断方面的研究进展。
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