目的：建立检测梅毒螺旋体(TP)、单纯疱疹病毒(HSV)和杜克雷嗜血杆菌(HD)的双色荧光定量聚合酶链反应(DC-FQ-PcR)方法，并评价其在诊断生殖器溃疡性疾病(GUD)病因中的临床价值。 方法：根据TP、HSV和HD的基因库序列设计引物对3株参考株进行扩增，证实其特异性；再设计探针做三种参考株的双色荧光定量PCR；以10倍稀释不同浓度模板扩增测定其敏感度；同时检测320份生殖器溃疡处分泌物标本，每份标本同时进行暗视野显微镜(D-F)、梅毒血清学试验(STS)、HD培养和酶免疫法(EIA)检查HSV抗原。 结果：用FQ-M-PCR检测TP、HSV和HD3株参考株均出现特异性扩增片段，扩增片段大小分别为227 bp、233 bp和238 bp；其敏感度为10拷贝/μ1。将DC-FQ-PCR用于检测320例生殖器溃疡分泌物标本，与D-F、TPHA、EIA法比较，有较好的一致性(Kappa分别为0.758、0.797、0.703)。 结论：DC-FQ-PCR是一种高灵敏度、高特异性的检测生殖器溃疡标本中TP、HSV、HD的方法；可用于临床GUD的病因诊断。