【摘 要】
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以TALEN和CRISPR/Cas系统(或称Cas9/gRNA系统)为代表的序列特异性核酸内切酶为基因组定点突变技术带来了革命性的飞跃.我们以斑马鱼为模式对该系统的成功率、工作效率、特异
【出 处】
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北京细胞生物学会第四次会员代表大会暨2014年年会
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以TALEN和CRISPR/Cas系统(或称Cas9/gRNA系统)为代表的序列特异性核酸内切酶为基因组定点突变技术带来了革命性的飞跃.我们以斑马鱼为模式对该系统的成功率、工作效率、特异性以及脱靶效应进行了综合研究与比较.常用的人源化的Cas9 (humanized Cas9,hCas9)能够成功突变28个斑马鱼靶点中的9个,成功率为32％;对90个位点进行的基因打靶实验结果表明,TALEN的成功率可达74％.为了提高Cas9/gRNA系统的成功率和打靶效率,我们根据斑马鱼的密码子偏好性优化了Cas9的编码序列(称为zCas9),可以将打靶成功率提高到54％;对于每一个所检测的位点,zCas9的效率均明显高于hCas9.我们编写了一个可以在任意已知基因组中寻找潜在脱靶位点的开放程序CasOT,用于检验Cas9/gRNA系统的特异性.我们选择了一个效率较高的靶点预测了斑马鱼中潜在的脱靶位点,并选择了21个脱靶位点进行了深入分析,结果表明该位点并没有明显的脱靶效应.上述结果表明,基于zCas9的Cas9/gRNA系统在斑马鱼中是一种高效、高特异性的基因打靶工具.
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